Robert W. Bradford D. Sc.¹, KeHsieng Ding²
1. Bradford Research Institute , CA, USA
Professor of Capital University, Washington DC 
2. FRC Free Radical Biology & Medical Research Center

ÖZET : Toksikolojik çalışmanın metodu ve içeriği;akut toksidite testi,total toksidite testi, farelerin polychromatic erythrocytes micronucleus testi, spermlerin hata testi ve FRC001'in Ames testi olarak belirlendi.Yapılan testler sonucunda ;Acute toxicity test, Birikim toxicity test ve FRC001'in Ames testinin normal olduğu,bunun yanında polychromatic erythrocytes'un micronucleus oranı ve FRC001 ‘in sperminde hata oranı kontrol gruplarından yüksek bulundu.Sonuçlar,FRC001'in kullanımının yönetilmesindeki yolları ve Edfrnn'nin güvenilir seviyesi ve dozaj'a ait bazı dataları yansıtmaktadır. Anahtar Kelime:FRC001;LD50;mutagenik;hata oranı,micronucleus oranı. 

DAHA ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR 

Toxicology çalışmasının esası; ilaçların toksiditesi ile içindeki ingridientlerin ve fizikokimyasal özelliklerin arasındaki ilişkilerin incelenmesidir.Absorpsiyon,dağılım, conversion, birikim ve ilaçların salgılarının kuralları yer almaktadır.İki tür toxikolojik test uygulanmıştır; in vitro ve in vivo test. Önceki testler;tüm hayvanlardaki acute toxicity test , total toxicity test, hata testi , mutagenik testleri içerir.Mikroorganizmalardaki Mutajenik testi de içerir.Klinik uygulamalarda FRC001'in toksikolojik değerlendirmeleri yer almakta.FRC001'in toksikolojik çalışmaları yapıldı.

MALZEME VE METODLAR

1. Malzemeler

1.1 Konu : FRC001.
1.2 Deney Hayvanları :
1.2.1 Fare , Kunming cinsleri , sağlıklı, 2~3 aylık, dişi ya da erkek.
1.2.2 Sıçan, Wistar cinsleri, sağlıklı, 3~4 aylık, 180~220g, dişi ya da erkek.Fare ve Sıçanlar , Tongji University ‘nin tıbbiye bölümüne ait Deneysel Hayvansal Merkezi‘dan elde edilmiştir. 
1.3 Deneysel Cinsler: Histidine dystrophic of Salmonella typhimurium TA98, TA100 ve TA102 Kalifornia Ames Laboratuvarından sağlanmıştır. 

2. Metodlar:

2.1 Akut toxicidite test: Horn'sun metoduna göre 15 fare random olarak 5 gruba bölündü. ( 21.5, 10.0, 4.64 ve 2.15g/kg. bw). Her grup dişi ve erkek olmak üzere 10 adet sıçan içerdi. FRC001 su ile seyrelti.Sıçanlar,endogastricly olarak ilaç ile günde 10 kez 2 hafta boyunca beslendi.

2.2 Artan doz metodu : 32 sıçan random olarak 2 gruba ,kontrol ve deneme grubu olarak bölündü.Her grup dişi ve erkek olmak üzere 16 sıçan içerdi.Deneme grubundaki sıçanlar FRC001 ile endogastricly ile başlangıçta 3.0g/kg. bw, sonra artan dozda; günlük 5.26 LD50 olacak şekilde 30 gün boyunca beslendiler.Kontrol grubu ise normal tuzlu su ile deneme grubunda olduğu gibi beslendi.

2.3 Micronucleus test : 15 fare random olarak 5 gruba bölündü.Bir grup negatif kontrol ,diğer positif grup ve 3 doz grubu olarak bölündüler.(4.3, 10.8, 21.5g/kg. bw).Her grupta 10 sıçan bulunuyordu.Bunların yarısı dişi yarısı erkek idi.Negatif grup 5g/kg. bw olacak şekilde distile su ile endogastricly'li olarak beslendi.Pozif gruba cyclophosphamide 100mg/kg. bw intraperitoneally olarak enjekte edildi ve 30 saat sonunda öldürüldüler. Diğer gruplar günde 1 kez endogastricly olarak 4 gün boyunca ilaç ile beslendiler. 5.günde öldürüldüler.Kuvvetli olanlar ayrıldı ve polychromatic erythrocytes'in iyileşmesi için hazırlandılar.Polychromatic erythrocyte ve micronucleus hücreleri sayıldı. 

2.4 Sperm hata testi : 40 erkek sıçan 5 gruba bölündü.Negatif ,pozitif ve 3 ilaç grubu (4.3 , 10.8, 21.5 g/kg. bw) olarak. Her grup 8 sıçan içerdi.Negatif gruptaki sıçanlar 21.5g/kg. bw (I.G.)olacak şekilde distile su ile beslendi, pozitif gruptaki sıçanlar cyclophosphamide ile 21.5g/kg. bw olacak şekilde beslendiler, ve ilaç grubundaki sıçanlar FRC001 ile beslendi. Onların hepsi intragastricly olacak şekilde günde bir kez 5 gün boyunca beslendiler,ve30 gün sonra normal beslenenler öldürüldüler..Epididymides ler ayrıldı , 5 ml.normal tuzlu su kondu , parçalar kesildi,sonra 36.5 °C su banyosuna minimum 15 dakika kondular.Total ve aktif sperm 200 olarak sayıldı. Sperm hata oranı boyama metodu ile sayıldı.

2.5 Ames test: FRC001 5 kez DMSO solüsyonu ile seyreltildi. Negatif kontrol grubunda;1:50, 1:200, 1:500, 1:2000 ve 1:5000. DMSO , Dexon ve 2,7-diaminofluorene positive kontrol grubunda kullanıldı. Dexon ,direkt mutajen olarak kullanıldı ve 2,7-diaminofluorene ‘da indirekt mutajen olarak kullanıldı.Detay için reference (4)'e bakınız.

SONUÇLAR VE GÖRÜŞLER

1.FRC001'in AKUT TOKSİDİTE TESTİ :

Akut toksidite test metoduna göre testler yapıldı.2 hafta sonraki gözlemlerde; FRC001 ile beslenen tüm hayvanlar ila normal beslenen ve su ile beslenenlerin aktiviteleri anormal bulunmadı.Vücut ağırlıkları aşikar belirgin şekilde değişmedi.Test peryodu boyunca hiçbir hayvan ölmedi.FRC001'in LD50'si ağız ile alanlarda 21.5g/kg.bw.dan fazla.

2.Edfrnn'nin Birikim Toksiditesi

2.2 Farelerin ana organ katsayısı üzerine etkisi ( Tablo 1)

Tablo 1. Wistar Faresinin ana organ katsayısında FRC001'in etkisi

2 grup arasındaki fark önemli değil , P>0.05

Tablo 1'e göre ve Şekil 1,2, FRC001 ‘in vücut ağırlığı ve 30 gün boyunca intragastric beslenenlerin ortalama vücut ağırlıklarının artışında belirgin etki yoktur.Gıda alımı ve aktivite normaldir.Toxik reaksiyon bulunmadı. Organlar pathological incelemede normal bulundu.Kontrol grubu ile deney grubu arasında önemli bir fark bulunmadı(P>0.05). Kümilatif doz,30 günde 5.26 LD50'e çıktı.Hiçbir hayvan ölmedi.Sonuçlar FRC001 ‘in kümilatif toxiditesinin olmadığını gösterdi. 

3. Farelerin micronucleusrate'in bone marrow cell üzerine FRC001 ‘in etkisi (Şekil 3, 4) 

Genellikle micronucleus testte, cyclophosphamide ‘in the micronucleus oranı(positive kontrol grubunda) 0~3%'dir,negatif kontrol grubunda micronucleus oranı 3%.'den azdır.Şekil 3,4, e göre pozitif kontrol grubunda micronucleus oranı 30.3% ve 1.4%, Yapılan testlere bağlı olarak FRC001'in az,orta ve yüksek dozunda micronucleus oranı sırasıyla; 4.5%, 6.6%, 9.0%, Edfrnn grubu ve negatif kontrol grubu arasındaki fark önemlidir.Bu bulgular FRC001 mutagenik etkiye sahip olduğunu gösteriyor.

4. Sıçanların sperm hatasında FRC001'in etkisi (Tablo 5 ve Tablo 2)

Tablo 2 Sıçanların sperm hatasında FRC001'in etkisi

Şekil 5 Sıçanların spermlerinde hata oranında FRC001'in etkisi

Tablo 2'ye göre , FRC001'in 3 dozunda spermlerde hata oranı ve pozitif kontrol grubu negatif kontrol grubuna göre daha yüksek bulunmuştur. Genellikle,negatif kontrol grubunun hatalı sperm oranı pozitife göre iki mislidir.Bu testte,pozitif kontrol grubunda hatalı sperm oranı ,negatif kontrol grubunun 6 katıdır.FRC001'in düşük ve yüksek dozlarında; 1.2, 2.1 ve negatif kontrol grubunun 3 katıdır. Fark önemlidir(P<0.05, P<0.01). Tüm bulgular FRC001'in canlı hücresinin kalıtımında bazı zaralı ve toksik etkilerinin olduğunu gösteriyor 

5. FRC001'in Ames testi (Tablo 3) 

Tablo 3 FRC001'in ames test sonuçları

Tablo 3'e göre,FRC001'in Ames test'inin yapımındaki metodunun kullanımını içermekte, mutagenik kolonini (Rt) oranı (MR) ve değişen spontane mutajen koloni (Rc) 2 den daha azdır.Sonuçlar, FRC001'in belirgin şekilde mutajenik aktiviteye sahip olmadığını göstermektedir. Dexon'un MR'si ve 2,7-diaminofluorene 2 den yüksektir,Ames testi positif ve onlar mutajenik aktiviteye sahiptir. DMSO'nun MR ‘si 2'den az olduğu görülür ve mutajenik aktiviteye sahip değildir.Sonuçlar testlere bağlı olarak görülmektedir. 
Sonuçta,FRC001'in toksikolojik testi,akut toxidite testi, cumulatif toxidite testi ve Ames testi normal olamasına karşın micronucleus testi ve sperm hata testi normal değildir. Genellikle,mutajenler nedeniyle micronucleus'un ters etkilişimine neden olduğu düşünülebilir,mutajenlerin aktivasyonu sonucu kromozomların parçaları bu micronucleusları içerir.Micronucleus oranı tamamiyle kromozomların hatası ile tamamiyle ilgilidir. FRC001sıçanların sperm hata oranının kalıtsal olarak muhtemel bir zararda arttığı görülmektedir.Gıda ve ilaçların toksikolojik metod ve tahmin prosedürlerine göre hükümetler tarafından yayınlanır;eğer 2 pozitif kalıtsal toksikolojik analiz var ise ve kısa sürede yapılan testlerde toksiditi görülüyorsa ;eğer kısa süreli testlerde şüpheli pozitif sonuç alınıyorsa,uygulamalarda konunun muhtemel girişi ve önemi tanımlanır.FRC001'in sperm hata oranı testi ve micronucleus ların pozitif testi ingridientlerle bağlantılıdır, ingridientlerin interaksiyonu ve /ya da FRC001'in hazırlanması ,yeni ürünlerin formasyonu boyunca gelişimine bağlıdır.Biz uygulama departmanlarına ,klinik uygulamalarda kullanırken,FRC001'in mugenasyonu üzerinde düşünülmesini öneriyoruz.FRC001'in toksiditesi kontrollü dozla ya da küçük miktarlarda azaltılabilir.  

REFERANSLAR 

[1] Qian Jiaqing, Song Ruikun, The Materia Medica and Toxicology Basis. 1st Edition , The People's Medical Publishing House, Beijing, 1986,258

[2] Ding KeHsieng, Song Ruikun, The Acute Toxicity Test of SOD Atomic Energy Press , Beijing, 1991:84

[3] Ding KeHsieng, Yao Shuren, Song Ruikun, The Cumulative Toxicity Test of SOD Complex Enzyme and Its Preparation, Application Study on SOD, Atomic Energy Press, Beijing, 1991,94

[4] Qian Jiaqing, Song Ruikun, Pharmacology and Toxicology Basis, The People's Medical Publishing House, Beijing, 1986,225

[5] Yu Shouyang, Liu Yugu, Animal Experiment in the Food Toxicologic study, The People's Medical Publishing House, Beijing,1981:379~383

[6] Cai Hong Dao, Wan Jialing, Enviromental Microorganism, Tongji University of Medical Science Press, Wuhan, 1987:269~275

[7] Ding KeHsieng, Ames test of SOD Complex Enzyme and its Preparation, Application Study on SOD, Atomic Energy Press, Beijing, 109~113 

[8] Zhu Honghong, Huang Xingshu, PCD Method and Its Application in the study of the Influence of Exogenous Hormone on PCD of Testicular Cells. Canceration, Aberration Mutation 1997,9(1):23

[9] Yang Enpu, Yang Cangzhen, The Aberration Effects of Lead and X-ray on rats. Canceration Aberration Mutation 1996,8(6): 18

[10] Zhang Chen, Yao Hua, Ling Bing, et al. The Effects of Arsenic on Reproduction and Filial Generation Development of Rats. Canceration. Aberratin Mutation, 1997,9(1):32

[11] He Qingyu, Yin Muquan, Lu Dun, et al. Study of the Aberration of on Rats Canceration Aberration Mutation, 1997,9(1)38

[12] Liu Yugu, Health Toxicology Basis, The People's Medical Publishing House, Beijing, 1996; 56

[13] Maron D. M. et al. Revised methods for the Salmonella Mutgenicity Test. Mutation Res, 1983;113:173-190

[14] Blakey BR. Et al. The Effect of Methylmerury Tetrathyl lead and sodium arsente on the humoral immune respone in mice. Toxicol Appl Pharmacol. 1980,52(2):245 

[15] Koller LD. Chemical induced immunomodulation. J Am Vet Med Assoc. 1982, 181(10): 1102

[16] The Health Ministry of China, The Estimation Procedure and Method of Toxicology and Safety of Food, 1994,8:10

[17] Eudak E. Jacobs PA, Yangangimachi R, et al. Direct analysis of the chromosome constitution of human spermatozoa. Nature, 1978; 274:911

[18] Martin RH, Hildebrand K, Yamamoto J, et al An increased frequency of human sperm chromosomal abnormalities after radiotheraphy. Mutat res,1986; 14:219

[19] Brandriff B, Gordon LA, Sharlip I, et al. Sperm chromosomal analysis in a survivor of seminoma and associated radiotheraphy. Environ Mol Mutagen, 1987;9(Suppl 8):19

[20] Jenderny J, Rohrborn G. Chromosome analysis of human sperm. 1. First results with a modified method, Hum Genet, 1987;76:385

[21] Genesca A, Miro R, Caballin MR, et al. Sperm chromosome studies in individuals treated for testicular cancer. Ilum Reprod, 1990;5(3):286

[22] Kamiguchi Y, Tateno H, Shimada M, et al. X-ray induced chromosome aberrations in human spermatozoa. In: Mohri H, ed. New Horizons in Sperm Cell Research. New York: Japan Sci Soc Press, Tokyo/Gordon and Breach Sci Publ, 1987:117-123

[23] Kamiguchi Y, Tatcno H, Mikamo K. Dose-response relationship for the induction of structural chromosome aberrations in human spermatozoa after in vitro exposure to tritium ß-rays. Mutat Res. 1990;228:125

[24] Brandriff BF, Gordon LA, Ashworth LK, et al. Chromosomal aberrations induced by vitro irradiations: Comparison between human sperm and lymphocytes. Emviron Mol Mutagen, 1988;12(2)167

[25] Kamiguchi Y, Tateno H, Mikamo K. Types of structural chromosome aberrations and their incidences in human spermatozoa X-irradated in vitro. Mutat Res, 1990;228:133

[26] Yanagimachi R. Katayose H, Matauda J, et al. Stability of mammalian sperm nuclei. In:Spera G>et al, eds. Molecular and cellular biology of reproduction New York: Raven Press, 1992:157-168

[27] Lauria A, Gandolfi F. Recent advance in sperm cell mediated gene transfer. Molecular Reproduction and Development, 1993;36:255

[28] Kaufman MH, Analysis of the first cleavage division to determine the sex-ratio and incidence of chromosome anomalics at conception in the mouse, J Reprod Fertil, 1973;35:67-72

[29] Martin-Deleon PA, et al. Spontaneous heteroploidy in one-cell mouse embryes. Cytogenet Cell Genet, 1983;35:57-63

[30] Akira Nishio. Sister - chromatd exchange and chromosomal aberrations by DHAQ and related anthraquinone derivatives in Chinese hamster ovary cells. Mutat Res,1982;101:77

[31] Kaufman MH. Analysis of the first cleavage division to determine the 
sex-ratio and incidence of chromosome anomalies at conception in the mouse.
J Eprod Fertil, 1973;35:67

[32] Martin-Deleon PA, et al. Spontaneous heteroploidy in one-cell mouse embryes. Cytogenet cell Genet, 1983;35:57

[33] Dunkel VC, et al. Comparative neoplastic transformation responses of Balb/3T3 cell, syrian hamster embryo cells and Rauscher Murine leukemin Virus-infected Fisher 344 rat embryo cells to chemical compounds. INCI, 1981;67:1303

[34] Tates AD, Dietrich AJJ, de Voger N, et al. Micronucleus method for detertion of meiosis micronuclei in male germ cells of mammals. Mutat Res, 1983;221:131-138

[35] Lahdetie J, Parvinen M. Meiotic micronuclei induced by X-rays in early spermatids of the rat. Mutat Res, 1981;81:103-115

[36] Oakberg EF. Duration of spermatogenesis in the mouse. Nature (London), 1957;
180:1137-1138

[37] Maron BM, et al. Revised methods for the Salmonella mutageniecity test. Mutat Res, 1983;113(3):173

[38] Matsuoka A, et al. Chromosomal aberrations tests on 29 chemicals combined with S9 mix in vitro. Mutat test, 1979:66(3):277

[39] Jones PD, et al. Efficiency of fuconazole in cryptococcal meningitis. Diagn Microbiol Infect Dis, 1989:12(4Suppl)235s

[40] Lee JW, et al. Safety and pharmmacokinetics of fluconazote in children with neoplastic diseases, Pediatr.1992:120(6):987

[41] Vicki L, et al. Review of the mutagenicity of ethylene oxide. Envirommental and molecular mutagenesis, 1990:16:85-103

[42] Ehrenberg L and Bowman Ko. Tables for determining the satistical significance of mutation. Mutat Res,1970:9:527-549

[43] Kastenbaum MA and Bowman KO. Tables for determining the statistical significance of mutation. Mutat Res. 1970:9:527-549

[44] Riberio LR, et al. Cytogenetic effects of inhaled ethylene oxide in somatic and germ cells of mice. Arch. Toxical 1987:59:332-335

[45] Tates AD, et al. Biological and chemical monitoring of occupational exposure to ethylene oxide. Mutat Res,1991,250:493-497

[46] Hogstedt B, et al. Chromosome aberrations and micronuclei in bone marrow cells and peripheral blood lymphocytes in humans exposed to ethylene oxide. Heredites, 1983:98:105-113

[47] Symons JM et al. National organics recomaissance survay for halogenated organics. Water works Assoc., 1975:67(11):634

[48] Puck TT, et al. Clone growth of mammalian cells in vitro growth characteristics of colonies from single hela cells with and without "Feeder" layer. J Exptl Med, 1956:103:273

[49] Dipaolo JA, et al. Transformation of hamster cells in vitro by polycyclic hydrocarbons without cytotoxicity. Proc Nat Acad Sci U.S.A. 1971:68(12):2958

[50] Bruce cc. Et al. Enhancement of adenovirus transformation by pretratment of hamster cells with carcinogenic polycyclic bydrocabons. Cancer Res, 1973:33:819

[51] Dipaolo JA, et al. Quantitative studies of in vitro transformation by chemical carcinogens. J Nat Cancer Inst, 1965:35:867

[52] Geoge EM, et al neoplastic transformation of human epithelial cells in vitro after exposure to chemical carcinogens. Cancer Res. 1981:41:5096

[53] Dipaoli JA, et al. In vitro transformation of syrian hamster embryo cells by diverse chemical carcinogens. Nature, 1972:235:278

[54] Maron DM, BN Ames. Revised methods for the Salmonella Mutagenicity test. Mutat Res, 1983:113:173

[55] Quillardet P. Hofnung. M, The SOS Chromotest, a colorimetric bacterial asay for genotoxins procedures. Mutat Res, 1985:147:65

[56] Memahon RE, Cline JC, Thmopson, CZ. Assay of 855 test chemicals in ten tester strains using a new modification of the Ames test for bacterial mutagens. Cancer Res. 1979:39(3):682

[57] Rudak E, Jacobs PA, Yanagimachi R, et al. Direct analysis of the chromosome constitution of human spermatozoa. Nature, 1978:274:911

[58] Martin RH. Hildebrand K, Yamamoto J, et al. An increased frequency of human sperm chromosomal abnormalities after radiotherapy. Mutat Res. 1986:174:219

[59] Brandriff B, Gordon LA, Sharlip I, et al. Sperm chromosomal analysis in a survivor of seminoma and associated radiotherapy. Environ Mol Mutagen , 1987:9(Suppl 8):19

[60] Jenderny J, Rohrborn G. chromosome analysis of human sperm. I. First results with a modified method. Hm Genet, 1987:76:385

[61] Genesca A, Miro R. Caballin MR, et al. Sperm chromosome studies in individuals treated for testicular cancer. Ilum Reprod, 1990:5(3):286

[62] Kamiguchi Y, Tateno H, Shimada M, et al. X-ray induced chromosome aberrations in human spermatozoa. In:Mohri H, ed. New Horizons in Sperm Cell Research New York :Japan Sci Soc Press. Tokyo/Gordon and Breach Sci Publ. 1987:117-123

[63] Brandriff BF. Gordon LA, Ashworth LK, et al. Chromosomal aberrations induced by vitro irradiation:L comparison between human sperm and lymphocytes. Environ Mol
Mutagen, 1988:12(2):167

[64] Kamiguchi Y. Tateno H. Mikamo K. Types of structural chromosome aberrations and their indicences inhuman sermatozoa X-irradiated in vitro. Mutat Res, 1990:228:133

[65] Kamiguchi Y, Tateno H. Mikamo K. Micronucleus test in 2-cell embryos as a simple assay system for human sperm chromosome aberrations. Mutat Res, 1991:252:297

[66] Yanagimachi R, Katayose H, Matsuda J. et al. Stability of mammalian sperm nuclei. In: Spera G et al. eds. Molecular and cellular biology of reproduction. New York; Raven Press, 1992:157-168