FRC001 China No.1 Tian Xian Sıvı'nın Oksijensiz radikaller üzerindeki ve temizleme etkisi

Ba-Lu Zhao 1 Ph.D., Wen-Juan Xin 1 Ph.D., Chung-Yu Kao 2 MD, Hong Zhang 3 MD. Ph.D.
1. Institute of Biophysics, Academia Sinica, Beijing
2. FRC Free Radical Biology and Medical Research Center, Taipei
3. Department of Pathology, Univewrsity of Linkoping, Sweden

ÖZET

ESR, BJL-chemiluminescence ve diğer tekniklerle,FRC001'ın sulu,enzim,ışın ve hücre sistemlerinde,oksijensiz radikaller üzerindeki temizleme etkisi incelenmiş ve vitamin C ve E ile mukayese edilmiştir.RC001 ‘ın PMA ile uyarılan PMN , xanthine/xanthine oxidase,riboflavin/EDTA Iışınlaması ve Fenton Reksiyonları sonucu husule gelen oksijensiz radikallerin temizlenmesinde etkili olduğu görülmüştür.Aynı zamanda,FRC001'ın linoleic asit ve liposom'un lipid peroksidasyonu sırasında oluşan TBA reaksiyonuna uğramış(TBARM) maddelerle diene'lerin birleşmesini önleyebileceği ve etkili şekilde ONOO'yu temizleyebileceği de görülmüştür.

Anahtar Kelimeler : FRC001, Oksijensiz radikaller,lipid peroksidasyonu,ESR,BJL-chemiluminescence.

GİRİŞ

Aktif oksijensiz radikaller hücre komponentlerine zarar verebilir,hatta normal hücreleri öldürerek ,yaşlanmaya ve kanser ve kalp hastalığı gibi çok ciddi hastalıklara neden olabilir.Genellikle sağlıklı insan vücudunda,aktif oksijensiz radikallerin üremesi ve temizlenmesi dengelenmiştir.Eğer superoxide dismutase (SOD) veya katalaz gibi bazı enzimlerin normal mekanizmalarında bir dengesizlik oluşursa vücutta aşırı derecede aktif oksijen radikalleri birikir.Bu çeşit hastalıkların önlenmesi ve insan sağlığı açısından aktif oksijen radikallerinin temizleyiciliğinin yararlı olması mümkündür.Bu bakımdan Aktif Oksijen radikallerinin etkili temizleyicilerinin araştırılması çok önemlidir.Bu raporda ESP, BJL-chemiluminescence ve diğer tekniklerle , FRC001'ın sulu enzim,ışıma sistemi ve hücre sisteminde oksijensiz radikaller üzerinde temizleyici etkisi araştırılmıştır.FRC001'ın PM tarafından uyarılan PMA, xanthine/xanthine oxidase, riboflavin/EDTA ve Fenton Reaksiyonları sonucunda oluşan oksijensiz radikalleri etkili bir şekilde temizleyebileceği görülmüştür.Aynı zamanda linoleic acid ve liposomun lipid peroksidasyonu sırasında oluşan TBARM ile diene birleşiklerini de önleyebileceği görülmüştür.

MALZEMELER VE METODLAR

Kimyasal Maddeler : Sigma Chem Co.dan (5.5-dimethyl-pyrroline-1-oxide) DMPO alındı ve kullanılmadan önce aktif odun kömürüyle arıtıldı. PMA (phorbol myristate acetate), linoleic acid, lipoxidase, SOD (6500 U/mg), xanthine/xanthine oxidase (2.125 U/ml) ve luminol Sigma Chem Co.dan alındı,biraz aseton içinde eritildi ve kullanılmadan önce 50 mM phosphate ile uygun bir konsantrasyonda sulandırıldı.Diğer maddeler Çin'de yapılmış olup SOD faaliyetinin ölçülmesi FRCOO1'e dahildir.

BJL-chemiluminescence ölçümü : xanthine ve xanthine oxidase reaksiyonu luminol'e dayalı chemiluminescence veren oksijensiz radikaller üretilebilir.SOD bu sistemden üretilen chemiluminescence'yi temizleyebilir.Böylece SOD faaliyeti bu sistemle ölçülebilir.Ölçü sistemi 0.2 mM luminol, 0.32 mM xanthine, ve 0.09 U/ml xanthine oxidase içerir.Chemiluminescence WDD-1 chemiluminescencemetere ile ölçülmüştür.

FRC001'nun O2 üzerindeki temizleme etkisi şöyledir.;

E = ((ho-hx)/ho) X 100%

ho - xanthine/xanthine oxidase control sisteminin Chemiluminescence'sı

hx –FRC001 ilavesinden sonra xanthine/xanthine oxidase ‘ın chemiluminescence ‘dir.

Ölçüm sistemi yukarıdakinin aynısıdır,yalnızca sisteme değişik konsantrasyonda FRC001 ilave edilmiştir.İlk olarak ,bu sistemde SOD faaliyetinin standard bir eğrisi elde edildi.Sonra bu sistemde FRC001'in oksijensiz radikalleri,temizleme eğirisi ölçümlendi.Her iki eğriyi kullanmak suretiyle FRC001 solüsyonundaki SOD faaliyeti tesbit edilebilir.

Fenton reaksiyonunda üreyen OH'sız radikaller üzerinde FC001'in temizleme etkisi:

50 mM DMPO 1% H 2 O 2 ve 100 µM Fe(II) solüsyonu ferrous ammonium sulfate olarak karıştırıldı ve ESR ölçümü için quartz bir kapiler boru ile aktarıldı.FRC001'ın temizleme etkisi ölçülürken,sisteme değişik konsantrasyonda FRC001 solüsyonu ilave edildi.Temizleme etkisi yukarıdaki gibi hesaplandı,ancak burada hesaplama için ikinci tepenin yüksekliği kullanıldı.ESR Şartları:Bütün ESR spectra Varian E-109 ESR spectrometresine kaydedildi.Şartlar şöyledir;Mikrodalga gücü 20 mW. X-bandı, 1 G amplitud'lü 100 kHz modülasyon,merkezi manyetik alan 3250 G tarama genişliği 200G Zaman sabit değeri 0. 128 S, oda sıcaklığı.

FRC001'ın riboflavin/EDTA sisteminden ışınlamadan üreyen 02 üzerinde temizleme etkisi:

0.3 mM riboflavin, 5 mM EDTA ve 0.1 M DMPO karışımı quartz bir kapiler yardımı ile aktarıldı ve ESR spectrometresinin boşluğuna yerleştirildi.Numunenin 20 saniye bir xenon lambasıyla (500 W, mesafe 70cm),ışınlanmasından sonra, ESR spectrası derhal kaydedildi. FRC001'ın temizleme etkisi ölçülürken ,sisteme değişik konsantrasyonda FRC001 ilave edildi.Temizleme etkisi yukarıdaki gibi hesaplandı.Yalnız burada hesaplama için ilk tepenin yüksekliği alındı.ESR nın ölçülme şartı yukarıdaki gibidir..

Linoleic acitin lipoxidase ile lipid peroksidasyonundan ortaya çıkan birleşik diene'lerin temizleme etkisinin ölçülmesi

PBS'inde 0.1 mM linoleic asit , 480 U/ml lipoxidase ile karıştırıldı ve zamanla 232 nm de ölçüldü. FRC001'in birleşik diene'lerin oluşumu üzerindeki önleme etkisi ölçülürken,sisteme değişik konsantrasyonda FC001 ilave edildi.Temizleme etkisi yukarıdaki gibi hesap edildi.Ancak burada h ve hx ,kontrol ve numunenin reaksiyon hızları ile karşılıklı olarak kullanıldı.

Fe2+ tarafından başlatılan liposome'un lipid peroksidasyonundan ortaya çıkan TBA reaksiyonlu maddeler (TBARM) üzerinde FRC001'in temizleme etkisinin ölçülmesi:

Lecithine (10mg/ml) den yapılan Lipsom, Fe2+ (100 µM) ilave edilerek peroksid elde edildi.sonra 95ºC'de 6.7 mg/ml TBA ve 0.05 M HCL ile karıştırıldı.Numune 60 dakika sonra 95 C kuvöze konuldu,sonra oda ısısında soğutuldu.Butanol: methanol (85:15)ile TBARM çekildi ve 532 nm de . When the inhibition effects of FRC001 were measured, different concentrations of FRC001 were added in the system. The scavenging effect was calculated as above.ölçüldü.Sonra sistem değişik konsantrasyonda FRC001 ilave edilerek FRC001'in önleme oranı ölçümlendi.Temizleme oranı yukarıdaki gibi hesaplandı.PMN ile uyarılan PMA ‘dan üretilen oksijensiz radikaller üzerinde FRC001!in temizleme etkisi PMN'nın izole edilmesi:

PMN'nin izole edilmesi: Pekin Kızılhaç kan merkezinden sağlıklı donörlerden elde edilen taze kan alındı. 6% dextran çökeltisi kullanılarak PMN diğer hücre birleşiklerinden ayrıldı.

PMA ile uyarılan PMN'den üretilen aktif oksijensiz radikallerin elde edilmesi ve ölçülmesi:Tipik bir deneyde; 10 7 /ml PMN, 0.1 mM DETAPAC (diethylentriaminepentacetic acid) ve 100 ng/ml PMA karışımı 37ºC'de 2 dakika inkübatöre konduldu sonra , BJL-chemiluminescence ile ölçülmeden önce, 0.1 M luminal ilave edildi,homojen bir şekilde karıştırıldı.FRC001'ın temizleme etkisi ölçülürken sisteme değişik konsantrasyonda FRC001 ilave edildi.Temizleme etkisi yukarıdaki gibi hesap edildi.

FRC001 ‘ın ONOO üzerindeki temizleme etkisi;

Peroxynitrite sentezi : Peroxynitrite su soğutmalı bir akım reaktöründe senteze kondu. [12]. (i) 0.6 mol/L NaNO 2 , ve (ii) 0.6 mol/L HCL/0.7 mol/L H 2 O 2 solüsyonu 26 ml/min bir T-bağlantısısına pompalandı ve 3 mm çapında 2.5 cm cam tüp içinde karıştırıldı. Nitrous asidin H2O2 ile asit katalizörlüğü neticesinde oluşan peroxynitrous asid cam tübün diğer ucundaki ikinci bir T-bağlantısına aynı hızla pompalanan 15 mol/L NaOH ile soğutuldu.Artan H2O2, 4g tanecikli MnO2 ile doldurulmuş 1 X5 cm lık kolon üzerindeki geçitten alındı.Solüsyon bir hafta kadar –20 ºC de donduruldu. Peroxynitrite luminol ‘u okside edip çok kuvvetli chemiluminescence verebilir. FRC001'in peroxynitrite üzerindeki temizleme etkisi chemiluminescence metodu ile ölçüldü ve temizleme etkisi yukarıdaki gibi hesaplandı.

SONUÇLAR ve YORUM

1- Xanthine/xanthine oxidase sisteminden üretilen oksijensiz radikaller üzerinde,FC001'in temizleme etkileri.

•  Xanthine/xanthine oxidase'dan üretilen serbest radikaller üzerinde SOD'un temizleme etkilerine ait standart eğri Şekil.1 de gösterilmiştir.

SOD faliyeti (U/ml)

Şekil 1. Xanthine/xanthine oxidase sisteminden üretilen serbest radikaller üzerinde SOD'un temizleme etkilerini gösteren standard eğrisi

Xanthine/xanthine oxidase sisteminin reaksiyonundan üreyen oksijensiz radikaller üzerinde FRC001 ‘in temizleme etkileri Şekil 2.de gösterilmiştir.

Şekil 2. Xanthine/xanthine oxidase sisteminden ortaya çıkan oksijensiz radikaller üzerinde FRC001'in temizleme etkisi.

Yukarıdaki iki eğriden 1g FRC001 ‘daki SOD Aktivitesi hesaplanmış ve 300.000 U/ml.olarak bulunmuştur.

2.PMA ile uyarılmış PMN ‘den üretilmiş oksijensiz radikaller üzerinde FRC001 ‘ın temizleme etkisi

PMN uyarıldığı zaman veya phagocytes ve aktif oksijensiz radikal oluşur.Bu proseste oluşan aktif oksijen radikalleri mikrobik ve tümoral olaylarda ve sağlıklı vücudu hastalıklardan korumada önemli bir rol oynarlar.Fakat vucutta fazla aktif oksijen radikalleri var ise ,bunlar hücre bileşenlerine zarar verirler,hatta normal hücreleri öldürürler ve böylece kanser ve kalp hastalığı hastalıklarına ve yaşlanmaya neden olurlar.Burada bu husus FRC001 ‘in oksijensiz radikaller üzerindeki etkilerini incelemek için kullanılmıştır.Şekil 3 BJL-chemiluminescence ile ölçülen PMA ca uyarılan PMN ‘nin ürettiği oksijensiz radikaller üzerinde FRC001 ‘in temizleme etkisini göstermektedir.Tesbitlere göre C 50 =0.62 mg/ml olup bu vitamin C (C 50 =0.2 mg/ml) den küçük ,Vitamin E'den büyüktür.

Şekil 3. PMA'nın uyardığı PMN tarafından üretilen oksijensiz radikaller üzerinde FRC001 ‘in temizleme etkisi

3. FRC001'ın Fenton's Reaksiyonundan ortaya çıkan OH'siz radikaller üzerindeki temizleme etkisi

Fenton Reaksiyonu OH üretebilir ve OH sız radikallerin temizleme olgularının incelenmesinde kullanılmaktadır.

H 2 O 2 + Fe² + -> · OH+OH - + Fe 3+

Burada FRC001'in OH siz radikaller üzerindeki temizleme etkisinin incelenmesinde kullanılmıştır. DMPO-OH Şekil 4'de gösterilmiştir. 4b (a N =a H =14.9G). FRC001 ‘in OH üzerindeki temizleme etkisi Şekil 5'de gösterilmiştir.

Şekil 4. DMPO'nun ESR spektrasında, riboflavin/EDTA sisteminde üretilem O2 (a) ve . Fenton reaksiyonundan ortaya çıkan OH sız radikaller (b).

FRC001'ın temizleme etkisi Şekil 5 ‘de gösterilmiştir.FRC001 ,Fenton reaksiyonundan ortaya çıkan hidroksilsiz radikalleri etkili bir şekilde temizleyebilir.Ancak C vitaminin hidroksilsiz radikaller üzerindeki temizleme etkisi azdır.E vitamini 5 mg/ml konsantrasyonunda yalnızca % 37.5'luk bir temizleme etkisi verir.

Şekil 5. FRC001 ‘in Fenton Reaksiyonundan ortaya çıkan OH sız radikallerin üzerindeki temizleme etkisi.

4- FRC001 ‘ın ışınlandırılmış riboflavin/EDTA sisteminden üretilen 02 üzerindeki temizleme etkisi

    Işınlanmış rıboflavin/EDTA O 2 üretiminde ve O 2 - nin foto sistemindeki temizliyiciliğinin incelenmesinde kullanılmaktadır.Burada FRC001'in O2 üzerindeki temizleme etkisinin incelenmesinde kullanılmaktadır. O2'nin ESR spektrumu ışınlanmış rıboflavin'den üreyen DMPO-OOH ‘a yaklaşır ve Şekil 4'de gösterilmiştir. (a N =14.3, a H ß =11.3G,a H y =1.25G).

FRC001'ın ışınlanmış Riboflavin/EDTA sisteminde oluşan O2 üzerindeki temizleme etkisi Şekil 6'da gösterilmiştir.50% ‘lik bir temizleme için FRC001'in konsantrasyonunun yaklaşık 17 mg/ml. dir.Bu Vitamin C'nin temizleme etkisinden küçük (C 50 = 0.0009 mg/ml) fakat Vitamin E'nin kinden kuvvetlidir.

Şekil 6. FRC001'in ışınlanmış riboflavin/EDTA sisteminde oluşan O2 üzerindeki etkisi

1. FRC001 ‘in Linoleic asidin lipoxidase tarafından lipid peroxidasyonundan oluşan birleşik Diene'ler üzerinde önleme etkileri.

Birleşik diene'ler lipid peroxidasyonunun ilk aşamasında ortaya çıkar ve 233nm. Emişe sahiptir. FRC001 ‘in lipoxidas'ının katalizörlüğünde linoleic asitin lipid peroksidasyonundan oluşan birleşik diene'ler üzerindeki önleyici etkileri Şekil 7'de gösterilmiştir.Bu eğrilerden görüleceği üzere sisteme FRC001 konsantrasyonu ilavesiyle,önleyici etkiler arttırılmaktadır. FRC001 ‘ın konsantrasyonu 0.35mg/ml iken yaklaşık 20% birleşik Diene'ler temizlenmiştir.Konsantrasyon arttırıldığı zaman ,233 nm deki emilme artmış böylece yüksek konsantrasyon tesbitleri zorlaşmıştır..

Şekil 6. FRC001'ın Linoeic asid'in Lipoxidase tarafından lipid peroxidasyonundan üreyen birleşik diene'ler üzerindeki önleyici etkileri

1. FRC001 ‘ın liposome'nın lipid peroxidasyonundan üreyen TEA reaksiyonuna uğramış maddeler (TBARM) üzerindeki önleyici etkileri.

    FRC001'ın liposome'ın lipid peroxidasyonundan oluşan TBA reaksiyonlu maddeler üzerindeki önleyici etkileri Şekil 7.de gösterilmiştir.Eğriden görüleceğe üzere FRC001'in konsantrasyonunun artması TBARM üzerindeki önleyici etkiyi arttırmaktadır. 50% ‘lik bir önleyicilik için konsantrasyon yaklaşık 19 mg/ml.dir. TBA reaksiyonlu maddeler üzerindeki bu önleyici etki C Vitamininkinden (C 50 =1mg/ml) küçük,ancak E Vitamininkinden büyüktür.

Şekil 7. FRC001 ‘in Fe 2+ . İle başlatılan liposome'ının lipid peroxidasyonundan üreyen TBARM üzerindeki önleyici etkileri

1. FRC001 ‘ın peroxynitrite üzerindeki temizleyici etkisi

                Nitrik oxide'in bir çok biyolojik fonksiyonları vardır.Damarlı,düzgün hücreleri gevşetebilir,kan plateletlerinin pıhtılaşmasını önleyebilir(EDRF) ve nötron transformasyonunda messengerleri çevirebilir.Nitrik Oksit L-arginine ‘den biosentezi hücre foksiyonun düzenlenmesine ve iletişime bir yol olabilir.Makrofajlar, cytotoxic silahlarının bir parçası olarak nitrik oksit üretirler.Diğer taraftan ,eşleşmemiş bir elektronu olan nitrik oksit paramagnetik ve aktif serbest redikaldir. ·O 2 ile reaksiyona girerek peroxynitrite anyonunu üretir.(ONOO-). Alkali solüsyonlarında,ONOO - dengededir.fakat 0°C'da 6.6'lık bir pKa'sı vardır.ve protonlandığında hızla çürüyerek ,aşağıdaki reaksiyona uygun olarak ,serbest radikal verir.

O 2 + NO -> ONOO - + H + -> ONOOH  -> · OH +NO 2

Son zamanlarda , bir çok patalojik vakada ,nitrik oksidin 0 2 - ile reaksiyona girerek cytotoxic türler verdiği görülmüştür.Peroxynitrite'in araştırılmasına çok dikkat edilmiştir.Sülfidrillerin oksidasyonu,lipid zarı,hücre toksiditesine ve bazı hastalıklara neden olur.Burada FRC001 ‘ın ONOO- üzerindeki temizleme etkisi ölçülmüş ve Şekil 8'de gösterilmiştir. FRC001 ‘ın etkili bir şekilde ONOO- (C 50 = 0.03 mg/ml).yu temizleyebileceği görülmektedir.Peroxynitrite üzerindeki temizleme etkisi C Vitamininden (C 50 = 0.00003 mg/ml) küçük fakat E Vitamininden kuvvetlidir.

FRC001,serbest radikallerin temizlenmesi teorisi esasına göre dızayn edilmiş bir ilaçtır.Yukarıdaki deney neticelerinden ,FRC001'ın etkili bir şekilde PMA ile uyarılan PMN'den xanthine/xanthine oxidase'dan ışınlanmış riboflavin/EDTA ‘dan ve Fenton Reaksiyonundan oluşan oksijensiz radikalleri temizleyebileceği bulunabilir.Aynı zamanda birleşik diene'ları,linoleic asit ve liposome'nın peroksidasyonundan oluşan TBA reaksiyonlu (TBARM) maddeleri ve ONOO-‘yu temizleyebileceği de bulunmuştur.

Bu neticeler, FRC001'ın hastalıklar üzerindeki iyileştirici etkisinin ,insan vucudundaki toksik oksijensiz radikallerin temizlenmesinden geçtiği fikrini verebilir.